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細(xì)胞學(xué)堂 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染必看的常見問題盤點(diǎn)

更新時(shí)間:2024-09-18  |  點(diǎn)擊率:379


細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源性核酸(如DNA、RNA)引入細(xì)胞內(nèi)的一種技術(shù),它主要用于基因表達(dá)、基因編輯(基因敲入/敲除)、蛋白質(zhì)功能以及細(xì)胞功能研究等。簡單來說,通過轉(zhuǎn)染,我們可以將新的遺傳信息帶入細(xì)胞,觀察這些信息對(duì)細(xì)胞行為的影響。




本期,我們將為大家?guī)?strong style="-webkit-tap-highlight-color: transparent; margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; visibility: visible;">細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類的介紹與常見問題解析,幫助您快速上手,確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。





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 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類

根據(jù)轉(zhuǎn)染方式分類


化學(xué)轉(zhuǎn)染:

使用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑(如脂質(zhì)體、陽離子聚合物等)將核酸包裹并引入細(xì)胞。這種方法操作簡便,適用于多種細(xì)胞類型。

物理轉(zhuǎn)染:

利用物理手段(如電穿孔、顯微注射、基因槍等),使細(xì)胞膜暫時(shí)性開放或直接將核酸注入細(xì)胞。這種方法適用于部分難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型,但需要專業(yè)設(shè)備。

生物轉(zhuǎn)染:

利用病毒載體(如慢病毒、腺病毒等)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染效率高,但同時(shí)成本高且具有一定安全風(fēng)險(xiǎn)。




根據(jù)轉(zhuǎn)染是否把外源核酸

整合到宿主染色體分類


瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:

將外源性核酸引入細(xì)胞,使其在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因,不整合在細(xì)胞的染色體上。核酸在細(xì)胞內(nèi)僅存在較短時(shí)間,適合于需要快速獲取數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn),能夠迅速檢測基因功能或表達(dá)。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:

將外源性核酸引入細(xì)胞,使其整合到細(xì)胞染色體中,實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)。通過篩選和擴(kuò)增,雖然建立過程較長,但提供了穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng),適用于生產(chǎn)和長期研究。





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 細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)



01

如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法?

目前細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要有物理、化學(xué)和生物三類轉(zhuǎn)染方法。物理轉(zhuǎn)染需要特定儀器、耗材及充分的轉(zhuǎn)染參數(shù)測試,才能獲得較好的轉(zhuǎn)染效果,一般實(shí)驗(yàn)室無法滿足物理轉(zhuǎn)染的硬件要求;化學(xué)轉(zhuǎn)染是目前較為通用的一種方法,其憑借價(jià)格便宜、操作簡單而被廣泛使用;但部分類型細(xì)胞對(duì)化學(xué)轉(zhuǎn)染不敏感,轉(zhuǎn)染效率低,此類細(xì)胞可嘗試生物轉(zhuǎn)染方法,也就是通過病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。但是需要注意的是,如果細(xì)胞自身是難轉(zhuǎn)染類型,即使用病毒感染也不一定會(huì)獲得理想的轉(zhuǎn)染效果。

02

為什么細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高?

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高可能是受到了以下因素的影響:

細(xì)胞類型和狀態(tài):轉(zhuǎn)染試劑對(duì)不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不盡相同;轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響較大,此外,細(xì)胞密度也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染試劑使用量:轉(zhuǎn)染試劑用量過多或過少都可能影響轉(zhuǎn)染效果,可根據(jù)說明書推薦的使用量進(jìn)一步梯度摸索,確定目標(biāo)細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。

核酸質(zhì)量:使用的DNA或RNA質(zhì)量不佳(如降解或污染)會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染操作:例如制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)孵育時(shí)間過長、轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞孵育時(shí)間不夠等都可能導(dǎo)致效率下降。

03

配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)一定要用無血清培養(yǎng)基嗎?

通常在準(zhǔn)備核酸和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液時(shí),建議使用無血清的培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)染試劑自帶的組分。因?yàn)檠逯泻写罅康牡鞍踪|(zhì),在轉(zhuǎn)染過程中,蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體/聚合物對(duì)核酸的吸附,影響轉(zhuǎn)染效率。現(xiàn)在市售的部分轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行了一些改進(jìn),可以在轉(zhuǎn)染時(shí)使用含血清的培養(yǎng)基,所以配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí),可根據(jù)使用的具體轉(zhuǎn)染試劑說明書,選擇是否使用無血清培養(yǎng)基。

04

電轉(zhuǎn)后細(xì)胞死亡率高,如何調(diào)整優(yōu)化?

細(xì)胞狀態(tài):細(xì)胞電轉(zhuǎn)前,保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好,排除細(xì)胞污染情況。

細(xì)胞密度:確保電轉(zhuǎn)細(xì)胞的密度適中,細(xì)胞密度過高或過低都可能影響轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞存活率。

電轉(zhuǎn)參數(shù):優(yōu)化電壓、脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù),針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞,確定最佳的電轉(zhuǎn)參數(shù)。

電轉(zhuǎn)緩沖液:使用合適的電轉(zhuǎn)緩沖液,確保能夠有效導(dǎo)電,同時(shí)減少細(xì)胞損傷。

05

轉(zhuǎn)染了抗性基因的細(xì)胞加藥篩選后,為什么都死了?

可能是受到了以下因素的影響:

加藥時(shí)間細(xì)胞在轉(zhuǎn)染帶抗性基因的質(zhì)粒后,需要24-48 h表達(dá)抗性基因,避免過早加入藥物進(jìn)行篩選,一般建議轉(zhuǎn)染48 h后再加藥,具體時(shí)間可以預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索下。

加藥濃度:若藥物濃度設(shè)置過高,超過了抗性基因能夠應(yīng)對(duì)的范圍,導(dǎo)致即使轉(zhuǎn)染了抗性基因,細(xì)胞也無法存活。

抗性基因:抗性基因選擇錯(cuò)誤或轉(zhuǎn)染過程中抗性基因發(fā)生突變或丟失,都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞抗性功能喪失。




以上是關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的分類介紹與常見問題解析,更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨,請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~


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